La basilica abbaziale di Santa Giustina fu costituita nel VI secolo sul luogo della tomba di Santa Giustina di Padova, martirizzata nel 304 su sentenza dell’Imperatore Massimiano di passaggio per Padova.
Attorno al 520 il prefetto e patrizio Opilione fece edificare la prima Basilica con l’attiguo Oratorio, riccamente decorata da marmi e mosaici
Attorno dell'anno 1000 il monastero fu affidato ai monaci benedettini che lo trasformarono in abbazia. Successivamente l'edificio fu colpito dal terremoto del 1117 che ne fece crollare gran parte. Nei secoli seguenti fu un continuo cantiere oggetto di vari rimaneggiamenti e fu solo nel 1606 che i lavori terminarono e venne definitamente consacrata.
Inoltre, grazie allo stretto rapporto con l'Università di Padova, si sviluppò la Biblioteca, che arrivò a registrare un patrimonio librario di circa 80.000 volumi, e una scuola di copisti e miniaturisti.
Tuttavia, nel 1797 con l’avvento della Repubblica Cisalpina, furono messi sotto sequestro i beni del Monastero e la Biblioteca venne spogliata del suo patrimonio librario più prezioso, spedito a Parigi e successivamente venduto, insieme a beni mobili e immobili, anche ad acquirenti privati. Infine, nel 1810 i monaci furono definitivamente cacciati e il demanio si impossessò del monastero, privandolo di tutti i suoi oggetti di valore, tra cui cento pregevolissime pitture.
Sotto il governo austriaco e italiano, il monastero fu adibito prima ad ospizio per soldati invalidi, poi ad ospedale militare e infine a caserma, magazzino militare e dormitorio delle truppe.
Fu solo nel 1917 che Papa Benedetto XV riconobbe all’abbazia di Santa Giustina i suoi antichi diritti e privilegi, affidandola ai monaci dell'Abbazia della vicina Praglia. Nel 1942 ritornò ad avere una propria comunità monasteriale, pur permanendo ancora oggi di proprietà statale e militare.